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Zentrallabor Zytometrie und Zellsortierung
Modernste Zellanalyse und Zellsortierung durch technische Innovation
Das Zentrallabor für Zytometrie & Zellsortierung (FCCF) wurde im Jahre 2000 als eine gemeinsam genutzte Einrichtung (Shared Resource Lab) des DRFZ, der Charité – Universitätsmedizin Berlin und des Max-Planck-Institutes für Infektionsbiologie etabliert. Mit umfangreichen Serviceleistungen und eigenen technologischen Innovationen bietet das FCCF Zellanalysen und Zellsortierungen auf modernstem Niveau an.
Methoden und Anwendungsgebiete
Die Durchflusszytometrie ist eine Analysemethode zur quantitativen Erfassung von physikalischen, biochemisch-zellbiologischen und immunologisch-genetischen Parametern von einzelnen Zellen, mit deren Hilfe verschiedene Zellmerkmale bestimmt werden können. Die Durchflusszytometer des FCCF ermöglichen die gleichzeitige Messung von bis zu 28 Merkmalen einer Zelle bei einem Durchsatz von bis zu 20.000 Zellen pro Sekunde.
In solch einem “Multicolor”-Ansatz, ist es möglich, Zellen von Patienten vor und während einer Therapie zu analysieren, um einen Therapieerfolg zu verfolgen, aber auch um die zellulären Prozesse einer rheumatischen Entzündung zu untersuchen.
In ähnlicher Weise können interessante Zelltypen nicht nur analysiert, sondern auch isoliert, und für weitere Analysen genutzt werden. Hierzu werden Zellen zunächst wie im Zellanalyser analysiert und dann in Tröpfchen verpackt, die eine spezifische elektrische Ladung erhalten und anschließend innerhalb eines elektrischen Feldes in Auffangröhrchen gelenkt werden. Mit speziell angepassten Sortierprotokollen können auch sehr empfindliche Zelltypen, wie z.B. Stroma- oder Plasmazellen oder in Kombination mit Voranreicherungsmethoden, wie der magnetischen Zellsortierung, auch sehr seltene Zelltypen, z.B. autoreaktive Lymphozyten analysiert oder sortiert werden.
Technologische Entwicklungen
Um die Sensitivität der Durchflusszytometrie zu verbessern entwickeln wir zusammen mit der Berliner Firma APE ein Multispektral-Zytometer. Mit diesem Gerät wird das gesamte Lichtspektrum einer individuellen fluoreszenz-markierten Zelle gemessen. Dadurch wird mehr Licht eingefangen und die Messempfindlichkeit erhöht.
Zusammen mit APE haben wir auch ein LED-basiertes Kalibrierungsgerät (quantiFlashTM) entwickelt. Damit können wir die gemessenen Lichtintensitäten der Fluoreszenzen einer Zelle absolut bestimmen und so die genaue Anzahl von Molekülen auf oder in der Zelle quantifizieren.
Gruppenleiter
Dr. habil. Hyun-Dong Chang
Technischer Leiter
Dipl. Ing. Toralf Kaiser
Wissenschaftliche Assistenz
Dipl. Biochem. Jenny Kirsch
Technische Assistenz
Ana Catalina Teichmüller (M. Sc.)
Wissenschaftler/Projektmitarbeiter
Dr. Kerstin Heinrich (Biologie)
Dr. Daniel Kage (M.Sc. Physik)
EU-gefördertes Drittmittelprojekt „PULZY“
Nahezu 2 Millionen Menschen in Deutschland leiden an entzündlich- rheumatischen Erkrankungen, darunter sind 20.000 Kinder. Um die Ursachen für diese Erkrankungen zu verstehen sind Messmethoden notwendig, die krankhafte Veränderungen an Zellen robust aufspüren und erkennbar machen. Solche Untersuchungen werden bislang häufig mit durchflusszytometrischen Methoden durchgeführt, die aber immer als Voraussetzung eine aufwändige Probenaufbereitung und das Anfärben der zu untersuchenden Zellen mit zellspezifischen Molekülen haben. Die dabei benötigten Prozeduren und Reagenzien können unerwünschte Auswirkungen auf die Zellen haben, wie z.B. Aktivierung, Beeinflussung immunphänotypischer Merkmale, Zellpermeabilisierung, Zellverlust oder Apoptose (Greve et al., 2006; Smiljanovic et al., 2012; Westendorf et al., 2014). Desweiteren weisen derzeit verfügbare Durchflusszytometer Einschränkungen im Hinblick auf die Anzahl messbarer Parameter, Messgenauigkeit, Sensitivität, Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit sowie Stabilität der Messung auf (Giesecke et al., 2017; Wang et al., 2017)
Im Rahmen des Forschungsprojekts „Pulsformbasierte Durchflusszytometrie und Zellsortierung“ sollen beide Punkte durch eine neuartige Analysemethode der pulsformbasierten Durchflusszytometrie adressiert werden. Ziel dieses Projektes ist die Erforschung, ob anhand einer Pulsformanalyse der Streulichtsignale Zellen identifiziert werden können, ob in Kombination mit der konventionellen Durchflusszytometrie eine Qualitätsverbesserung der Daten erreicht werden kann und unter welchen Voraussetzungen eine markerfreie Zellanalyse und Zellsortierung durchführbar ist. Das Forschungsprojekt wird in Kooperation mit der APE Angewandte Physik und Elektronik GmbH durchgeführt und hat eine Laufzeit von 3 Jahren (Beginn 01.10.2018).
Dieses Forschungsprojekt wird im Rahmen des „Programm zur Förderung von Forschung, Innovationen und Technologien (Pro FIT)” gefördert. Die Zuwendung wird aus Mitteln der Europäischen Union (EFRE) und des Landes Berlin kofinanziert (FKZ: 10165404).
Projektbeteiligte:
Toralf Kaiser
Claudia Giesecke-Thiel (MPI molgen)
Conrad von Volkmann (APE)
Kerstin Heinrich
Daniel Kage
Jenny Kirsch
- Kaiser, J. Kirsch,
A. Grützkau,
Patentnummer 9958393 :
‘Principle component analysis (PCA) – based analysis of discontinuous emission spectra in multi-chromatic flow cytometry’ - Kaiser, T. Kolbe, M. Kneissl,
Patentnummer: 9498550
‘Flow cytometer desinfection module’ - Kristen Feher, Toralf Kaiser, Konrad von Volkmann, Sebastian Wolf
Publikationsnummer: 20170322137
‘Method and system for characterizing particles using a flow cytometer’
1 Analyser MACSQuant (3-lasers) bobby_configuration
1 Analyser MACSQuant (3-lasers) MACS Quant Camilla
1 Analyser LSRFortessa (4-lasers)Wayne 6v2b4y3r 17022016
1 Analyser FACS Canto (3-lasers) Canto New
1 Analyser Symphony A5 (5-lasers) Janice 5b8v3r5yg7uv 23022017 1
2 Cell Sorter FACS Aria (3-lasers) ARIA Rowlf
1 Cell Sorter FACS Aria II (4-lasers) AriaII Floyd
1 Cell Sorter Influx (5-lasers)
1 Cell Sorter Sony MA900 (4-lasers) Konfiguration Sony MA900
Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin
Technische Universität Berlin
Angewandte Physik und Elektronik GmbH (A•P•E), Berlin
MPI für molekulare Genetik, Berlin
Giesecke, K. Feher, K.v. Volkmann, J. Kirsch, A. Radbruch, T. Kaiser, “Determination of background, signal-to-noise and dynamic range of a flow cytometer – a novel practical method for instrument characterization and standardization”, (under review)
Feher, K. von Volkmann, J. Kirsch, A. Radbruch, J. Popien, and T. Kaiser, “Multispectral flow cytometry: The consequences of increased light collection,” Cytometry A, Jun. 2016.
Comparison study of various flow cytometers using a novel ultra stable calibration light source. von Volkmann, K., Feher, K., Popien, J., Kaiser, T. Poster at DGfZ meeting, Berlin, 2015.
Classification of Flow Cytometry Samples with a Dimension Reduction and Binning Approach. Feher, K., Radbruch, A., Kaiser, T. Poster at Cyto conference, Glasgow, UK, 2015
Durchflusszytometrischer Service der FCCF
Um ein neues Konto zu erstellen, füllen Sie bitte das Anmeldeformular Userform aus und geben Sie es in der FCCF ab. Nach der Registrierung erhält der Nutzer Zugriff auf das Online-Buchungssystem. Dort können der Einsatz von Geräten, die Dokumentation von Experimenten und die Abrechnungen verwaltet werden:
https://eu.ilabsolutions.com/service_center/show_external/3558
Für die Benutzer stellen wir auch den zentralen Datenserver “Totoschka” zur Verfügung, um FACS-Daten zu speichern. Die Daten sind online zugänglich.
quantiFlash(TM)
In cooperation with the Berlin based company A.P.E. we developed quantiFlash. QuantiFlash is a LED based light source for scale calibration. This tool allows quantitative comparison of flow cytometers.
Multispectral Acquisition and Analysis of Flow Cytometric Data Using a Conventional Flow Cytometer
We introduced an experimental strategy, in which discontinuous emission spectra were acquired and analyzed by principal component analysis (PCA). In a proof-of-principle study we could show, that the simultaneous detection of up to 4 fluorochromes, which were all excited by a 488 nm Argon-laser could be resolved by the detection of a discontinuous emission spectrum. In other words we use a standard cytometer just by changing the optical filters as a multispectral cytometer. No further expensive modifications as described in the literature are required. For simplifying data processing, PCA algorithm have to be implemented in standard flow cytometry software. Altogether, our studies demonstrated for the first time new possibilities in combining fluorochromes with similar emission spectra.
A UV-C LED Sheath Fluid Desinfection Module for Flow Cytometric Cell Sorting
We have developed a flow through reactor, which sterilizes the sheath fluid at the point of use. The flow through reactor is comprised of a 35 LED array positioned on top of three concentrix channels through which the sheath fluid passes. We use Galliumnitrid (GaN) based UV-C (220-290 nm) LEDs, which have attracted increasing interest as novel UV-C radiation sources for applications in water purification and desinfection.
Compared to conventional gas-discharge lamps, UV-C LEDs have a compact form factor, operate at very low DC voltages, exhibit fast on/off switching capabilities, and their emission wavelength can be tailored to the optimum wavelength for germicidal effectiveness. We have installed the module in a FACS Diva cell sorter and have connected it to the sheath fluid tubing close to the nozzle. At a sheath pressure of 30 psi, we were able to reduce the number of microorganisms up to 1000-fold.
The cell sorter remained free of microorganisms for at least 7 days after the sterilization with bleach was performed.
Device to cool the sheath fluid on a FACS Aria
We developed a cooling device in order to keep the sheath fluid temperature on a FACS Aria constant. We found that the foccusing of the side-streams on a FACS Aria are temperature sensitve. Room and instrument temperature shifts of more than +/- 5K results in a defocusing of the side-streams and the recovery of sorted cells decreased drastically. Furthermore, the sensitivity of delayed lasers decreased due to instable laser-delay.
To overcome this effects we hold the sheath-fluid constant at 17°C by using our device.
Non invasive mixing of cells during long-term sorts
During long-term sorts cells often sediment at the bottom of the sample tube. In consequence, the threshold rate are instable or interupted and cells in the settlement are exposed to cytotoxin. In cooperation with Advalytix we modified their universal acoustic mixing platform “SAWStation4” so that we can implement it in a FACS Aria.
In our study we could show that the yield of sorted cells was about 5% higher compare to cells mixed by the original FACS Aria agitator. Moreover, we found less dead cells in sorted populations.
